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PCR不必“摸條件” 

PCR是分子生物學科研人員必做的實驗,為了擴增目的基因,經常要對PCR的體系進行“摸條件”,特別是一些GC含量高的目的基因或者DNA純度不高的樣本! “摸條件”成為PCR實驗最費時費力的工作!雖然市場上有很多PCR的MasterMix試劑,將酶、dNTP、反應緩沖液混合在一起,很方便客戶的使用,但僅僅是簡單的混合,極少公司對MIX的應用范圍進行廣泛的實驗和優化,只能做一些不復雜的PCR。
百泰克通過長時間、無數次的實驗優化,終于推出了適用范圍廣、穩定性良好的PCRMIX,是目前最“傻瓜”的PCR反應體系之一,不論是質粒、菌液、CDNA、基因組DNA、或者是直接裂解的粗提物,GC含量高達75%的模板,都能輕松擴增,不需要費力的“摸條件”!
本產品包含酶、dNTP、特殊穩定劑和優化的反應緩沖液,濃度為2x。DNA擴增時,只需加入模板,引物和水,使MasterMix溶液的濃度為1×即可進行反應。具有快速、靈敏度高、特異性強、穩定性好等優點。進行PCR擴增可以減少操作時間,避免因多步操作帶來的污染,特別適宜高通量篩選基因的擴增 ,Taq PCR MasterMix擴增產物可用于T/A克隆。本產品加入特殊穩定劑,37 ℃溫度下48 h仍然保持95%以上的擴增效率.儲存條件: -20 ℃一年有效,多次凍融不會影響活性,經常使用可放置于4 ℃。
本品為適應大部分PCR反應需要,Taq 酶量是按照PCR反應酶量上限所加,如出現PCR反應非特異性擴增明顯或者背景過高,可將Taq PCR MasterMix反應液適當稀釋后使用,可改善PCR擴增效果。
PCR反應液:

組成成分 50 uL體系
2X MasterMix 25 uL
上游 Primer(10 uM) 1-5 uL
下游 Primer(10 uM) 1-5 uL
模板:lamid DNA ~50 ng?
genomic DNA ~1000 ng
cDNA ~500 ng
粗提液 ~2 uL
滅菌蒸餾水至 50 uL

PCR擴增實例: 
 plasmid DNA擴增: 
1.提取的質粒DNA擴增 
以pUC19質粒為模板擴增100,250,500,1000,2000 bp片段,以pBS質粒為模板擴增1500 bp片段。
1

 

模板:pUC19質粒30 ng/50 μL or pBS質粒30 ng/50 μL
PCR擴增程序


循環數

Step

溫度

時間

1

1

94 ℃

2 min

35

1

94 ℃

45 sec

2

55 ℃

45 sec

3

72 ℃

2 min

1

1

72 ℃

5 min

2.質粒菌液直接擴增: 
以pUC19菌液為模板擴增100,250,500,750,1000 bp片段,以pBS菌液為模板擴增1500 bp片段。
1
模板:菌液OD600=0.8時2 μL /50 μL 
PCR擴增程序:同上a擴增程序同。

結果:Bioteke 2×power Taq PCR MasterMix試劑對于質?;蚓壕筛咝实臄U增。取擴增產物10 μL用1%瓊脂糖凝膠電泳進行分析可見明亮條帶。

二.genomic DNA擴增 
1.大腸桿菌DNA擴增 
1

模板:大腸桿菌DNA 50 ng/50 μL
PCR擴增程序


循環數

Step

溫度

時間

1

1

94 ℃

4 min

  
35

1

94 ℃

45 sec

2

58 ℃

45 sec

3

72 ℃

1.5 min

1

1

72 ℃

5 min

2.高GC含量的片段擴增 
a.人類基因組擴增(GC含量>60%) 
1
模板:人類基因組 100 ng/50 μL
Primer:PrimerF:5′-GGGAGGGGACCGGGGAACAGAG-3′
PrimerR: 5′-GAACAGTCCGTCACTTCACGTG-3′
PCR擴增程序


循環數

Step

溫度

時間

1

1

94 ℃

4 min

  
35

1

94 ℃

45 sec

2

60 ℃

45 sec

3

72 ℃

1.5 min

1

1

72 ℃

5 min

b.菌Streptomyces phaeochromo gene的片段擴增(GC含量>70%) 
提取菌Streptomyces phaeochromo gene進行PCR擴增
1

模板:菌Streptomyces phaeochromo gene 100 ng/50 μL
Primer:71%GCPrimerF:5’-CCACCGGCCGCAGAGCAC-3’
71%GCPrimerR:5’-AGACGAGTCCCTTGGTTGGTAGC-3’
74.3%GCPrimerF:5’-CTCATCGTCGGCGCCGTCCTGGTC-3’
74.3%GCPrimerR:5’-CGGTCGGCTCGCTCCTGCTCTTCC-3’
PCR擴增程序


循環數

Step

溫度

時間

1

1

94 ℃

4 min

  
35

1

94 ℃

45 sec

2

55 ℃

45 sec

3

72 ℃

1 min

1

1

72 ℃

5 min

結果:可見Bioteke 2×power Taq PCR MasterMix試劑對于原核或真核生物DNA均可高效。相較于同類的taq mix的擴增效率更高,且對于高GC含量也可得到很好的擴增。取擴增產物10 μL用1%瓊脂糖凝膠電泳如圖可見明亮條帶。

 cDNA擴增 
人類胎盤提取的總RNA反轉錄的cDNA擴增1.2 kbp片段
1
模板:人類胎盤提取的總RNA反轉錄的cDNA 200 ng/50 μL
Primer: PrimerF:5’-ATGGGCCTGGACATACAGAGCCTGGACA-3’
PrimerR:5’-ATTCGGAGATGACCCTCAGGGATGGCTT-3’
PCR擴增程序


循環數

Step

溫度

時間

1

1

94 ℃

2 min

  
35

1

94 ℃

45 sec

2

62 ℃

45 sec

3

72 ℃

1 min

1

1

72 ℃

5 min

結果:取擴增產物10 μL用1%瓊脂糖凝膠電泳可見清晰條帶。

 粗提液擴增 
1. 人類頭發粗提液擴增 
對人類頭發及血液等進行擴增時,通常的做法是將頭發中的DNA抽提出來再進行基因分析,但該方法的DNA純化步驟非常煩雜。這里探討將頭發經過裂解后直接作為樣品的擴增實驗。 
操作流程:將采集到的1根男性毛發毛囊用70%乙醇洗滌一次;用蒸餾水沖洗毛發兩次;在PCR管中加入15 μL裂解液65 ℃ 30 min,95 ℃ 15 min;將PCR管短暫離心,取4 μL裂解產物作為模板進行擴增 
1
模板:人毛發粗提液4 μL
Primer: PrimerF:5’-TCCACTTTATTCCAGGCCTGTCC-3’????????? 
PrimerR:5’-TTGAAATGGAATGGGAACGAATGG-3’??? 
PCR擴增程序


循環數

Step

溫度

時間

1

1

94 ℃

4 min

  
35

1

94 ℃

30 sec

2

55 ℃

30 sec

3

72 ℃

30 sec

1

1

72 ℃

5 min

2. 植物粗提液的擴增 
部分實驗室里經常進行植物的實驗,從植物中抽提DNA作為樣品進行PCR分析是個很繁雜而且費時的過程。在這里探討用簡便的一步法將植物組織處理后取其上清作為模板進行擴增分析的方法。 
操作流程:截取1-2片0.5-0.7 cm的小麥葉片放入1.5 mL 離心管中,加入100 μL溶液L,確保葉片浸沒在溶液中;95 ℃ 10 min;加入100μl溶液I;Vortex混合。取2 μL做模板擴增。 
1
模板:植物粗提液2 μL
PCR擴增程序:同毛發程序同。

結果:采用本方法,以人毛發及小麥的粗提液為模板擴增,取擴增產物10 μl用1%瓊脂糖凝膠電泳可確認到明亮的條帶。

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