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如何提取高質量RNA

1. 迅速滅活內源的RNA酶,以防止RNA降解。
以下3個方法均可有效使內源RNA酶失活:
1)用含離液(如胍鹽)的細胞裂解液收獲樣品,并立即勻漿。
2)用液氮瞬間凍結樣品。值得特別注意的是:組織塊必須保證足夠小,在浸入液氮的瞬間就能凍結,以確保瞬間令RNA酶失活。
3)立即將樣品置于RNAfixer無液氮RNA樣品儲存液中。它是一種水相、無毒的收集試劑,能立即穩定并保護完整、未凍結的組織和細胞樣品中的RNA。關鍵要點是組織樣品切片一定要夠?。?lt;0.5 cm),這樣RNAfixer才能在RNase破壞RNA之前迅速滲入組織塊中。
2. 使用正確的細胞或組織儲存條件
在樣品用液氮瞬間凍結之后,應該儲存在-80°C,千萬不能解凍。即使是置于含有胍鹽的裂解液中作勻漿前的短暫解凍,也會導致RNA的降解和損失。瞬間凍結的組織應該首先在超低溫條件下先研磨成粉,然后置于裂解液中進行勻漿。

RNAfixer使樣品儲存更為便利。儲存在RNAfixer中的細胞或組織可在室溫下穩定保存長達1個星期,在4°C可穩定保存長達1個月,或永久保存在-20°C。RNAfixer說明書下載.
3. 破壁方法
細胞或組織的徹底勻漿對RNA提取來說,是一個很關鍵的步驟,它能夠防止RNA的損失和降解。勻漿的方法應根據細胞或組織的類型來選擇。大部分培養的細胞可以置于細胞裂解液中,通過簡單的渦旋震蕩來勻漿;而動物組織、植物組織、酵母和細菌、真菌則常常需要更加劇烈的方法,通常用液氮研磨。比如說細菌(特別是革蘭氏陽性菌)的細胞壁,就需要溶菌酶消化來實現徹底的細胞裂解和RNA的最大回收。酵母和革蘭氏陽性菌通常還需要液氮研磨過程中加入玻璃微珠幫助破壁,酵母提取也可以加入諸如Lyticase等破壁酶幫助破壁,再用TRIpure或RNApure進行提取。
4. 選擇最好的RNA分離方法
現有眾多的RNA分離方法也許令人難以取舍。目前最簡單也是最安全的方法是柱式分離,如RNApure 因為操作簡單,時間短,純度高而受到大家的喜愛,RNApure不需要DNA酶消化DNA,節省了時間,避免RNA的降解,從而提高了產量;相對非柱式分離(如TRIZOL),去除蛋白及其他雜質干凈,提高了純度,對于細胞、組織、一般植物均非常適合。植物RNA的提取比較難抉擇,植物RNA提取受酚、多糖、蛋白雜質、次生代謝物含量的影響,一般用TRIZOL提取純度不高,而且很多植物用TRIZOL提取不出來。這時候可以選擇多糖多酚植物總RNA提取試劑盒(水仙、辣椒、胡蘿卜、玉米、百合、小麥、西紅柿、花菜、油菜等)和通用植物RNA提取試劑盒(適合絕大多數植物提取,包括:蘋果、葡萄、草莓、香蕉、龍眼、荔枝、草坪植物、松樹、杉樹、白樺、紫松果、彩葉草、一品紅、夾竹桃、垂葉榕、紫羅蘭、月季、天竺藍、牽?;ǖ龋?;非常值得一提的是血液(包括血清、血漿、腦脊液、其他液體)RNA的提取用TRIZOL和紅細胞裂解的方法效果都不好,紅細胞裂解液不含有RNA酶的抑制成分,這個過程RNA很容易降解,推薦使用TRIpure LS 或者血液總RNA提取試劑盒。
5. 消除環境RNase的污染
為了得到完整的、高品質RNA,在整個RNA制備過程中,當RNA離開強蛋白變性劑(如離液裂解液或酚)的保護時,避免引入新的RNase污染就非常關鍵。由于RNase幾乎是無所不在,所以必須確保與純化的RNA接觸的每一樣東西都是無RNase污染的。所有的表面,包括移液器、工作臺、玻璃器皿和制膠設備,都必須用表面去污凈化溶液如RNase噴霧清除劑 來處理過,去除各種溶液或者反應緩沖液中可能存在的RNase污染,可以用RNAsafe。必須保證一直使用無RNase的槍頭、試管和溶液,手套也應經常更換。
6. 低濃度RNA的沉淀
純化得到的RNA可能需要通過沉淀來濃縮,以滿足一些下游應用的需要。醋酸銨(NH4OAc) 沉淀(加0.1體積的5 M 醋酸銨、2-2.5體積的無水乙醇,-20°C放置25分鐘以上)可以很好地回收RNA。如果需要定量回收低濃度的RNA(ng/ml),可以采用共沉淀(如linear acrylamide糖原glycogen,、酵母yeast RNA )的方法。核酸助沉劑是linear acrylamide,當RNA用于RT-PCR分析時,線性的丙烯酰胺和DNase處理的糖原都可以作為理想的共沉淀劑,因為它們都不含DNA污染,糖原含量高會抑制PCR反應。酵母RNA和未處理的糖原會給樣品帶來核酸污染,有可能影響RT-PCR的結果。沉淀后,注意避免RNA沉淀過分干燥,因為這可能導致很難重新溶解。
7. 提取好的RNA如何儲存
如果只是短期儲存,重懸的RNA應放置于-20°C;如果是長期儲存的話,就應該放置于-80°C。盡管重懸于水或緩沖液中的RNA也可以儲存在-80°C,但保存RNAlong中的RNA沉淀則更加穩定,可以長期保存。我們推薦將RNA溶液分裝在幾支管中。這會避免反復凍融損傷RNA,并預防偶然的RNase污染。

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