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病毒RNA提取的返璞歸真  

    從血清中提取病毒RNA的試劑盒和方法有很多,從剛開始的TRIZOL提取,到以QIAGEN公司為代表的離心柱提取法,以及新近興起的磁珠提取法,那么到底哪種方法能夠得到最高的提取效率,特別是對于低濃度的病毒的時候?
    
   考慮到離心柱法和磁珠法的原理都是利用二氧化硅在特定條件下吸附RNA,必然有一定的吸附效率和一定的洗脫效率,不可避免的會損失一部分的RNA,導致下游實驗檢測不到,造成假陰性。為了避免這樣的損失,北京百泰克生物技術有限公司從最早的沉淀法開始進行改進和優化,最大限度的提高低濃度病毒的RNA提取效率,并推出了相應的病毒RNA提取試劑盒(RP9001),該試劑盒一經推出就得到了中國CDC和佑安醫院的高度認可,以下是佑安醫院所做的對比實驗,供大家參考(免費索取最新技術資料>> >>)。

 

實驗目的:

 

 

HIV-1 RNA提取及下游的RT-PCR實驗。

實驗材料:

分別采用百泰克公司:Viral RNA isolation Kit 50 perps Cat# RP9001(生產日期:2010-9-5),以及某知名品牌病毒RNA提取試劑盒

本次共檢測10例樣本,按照百泰克公司試劑盒標準操作程序:

1, 取1.5ml無RNA酶管,分別加入裂解液750ul,Carrier RNA 4ul,病毒樣本250ul。室溫孵育10分鐘,
2, 加入150ul氯仿,室溫孵育3分鐘。
3, 12000rpm,4℃離心10分鐘。
4, 將中層富含RNA液轉入另一個新的2.0ml的無RNA酶管中,加入1.2ml 100%乙醇,室溫孵育10分鐘,12000rpm,4℃離心10分鐘。
5, 去掉上清,加入700ul洗液RW,12000rpm,離心1分鐘。
6, 去掉上清,加入70%乙醇,12000rpm,離心1分鐘。
7, 去掉上清,風干RNA 5-10分鐘。等全部干燥后,加入30ul洗脫液,輕彈混勻。
8, 獲得的RNA溶液10ul用于HIV-1 耐藥檢測RT-1 PCR反應。其余凍存與-80℃。
9, RT-PCR步驟略。PCR結果圖見下:



同時,我們也用某知名品牌病毒RNA試劑盒對上述中的樣品也進行了重復。
操作步驟見標準操作步驟。結果見下圖(marker左邊):

體會:
總體感覺百泰克公司病毒RNA試劑盒在操作時間上需要大約1小時,完成一次提取。而另一知名品牌病毒RNA提取試劑盒需要0.5小時,時間為百泰克產品的一半。

這一知名品牌病毒RNA提取試劑盒較百泰克公司試劑盒簡單,幾乎無關鍵步驟,而百泰克試劑盒中需要提取離心后的富含RNA層液,需要小心,最后風干RNA時需要掌握程度。如果不能充分干燥,將影響下游實驗。試驗中需要使用氯仿,有刺激性。

從RNA提取效率上看,百泰克病毒RNA提取試劑似乎優于這一知名品牌病毒RNA提取試劑盒,結果見上圖。原因分析可能為:1.百泰克試劑標準操作要求樣本用量為250ul,而這一知名品牌病毒RNA提取試劑盒僅為140ul;2.這一知名品牌病毒RNA提取試劑盒采用離心柱過濾法,RNA洗脫效率可能不如干燥法。

從價格上看,百泰克公司試劑盒遠低于這一知名品牌病毒RNA提取試劑盒。

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